Особенности экспрессии eGFP гена у транспластомных растений табака Nicotiana tabacum L. CV. Petit havana

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Методом биобаллистики получены транспластомные растения табака, экспрессирующие репортерный ген egfp и ген селективного маркера aadA в составе бицистронного оперона. Исследованы особенности экспрессии гена egfp в двух группах транспластомных растений: семенного потомства, полученного от самоопыления, и растений, полученных в результате двух последовательных циклов регенерации из листьев исходных трансформантов. Проведен сравнительный флуориметрический анализ накопления рекомбинантного белка в группах транспластомных растений и ядерных трансформантов. Установлено, что количество рекомбинантного белка eGFP, накапливаемого в листьях транспластомных растений, оказалось неожиданно низким и не превышало уровня установленного для ядерных трансформантов. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что низкий уровень накопления рекомбинантного eGFP не связан c низким уровнем экспрессии трансгена или с присутствием в хлоропластах нетрансгенных копий пластидного генома. Вероятнее всего, это связано с ограничениями, налагаемыми на уровне трансляции рекомбинантных белков в хлоропластах.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. В. Сидорчук

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

П. А. Белавин

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

А. А. Загорская

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Т. В. Маренкова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

В. В. Кузнецов

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Е. С. Хайрулина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Е. В. Дейнеко

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sidorch@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Список литературы

  1. Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S.V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. P. 28747. https:doi: 10.1016/j.biotechadv.2010.05.022
  2. Rozov S.M., Sidorchuk Yu.V., Deineko E.V. Transplastomic plants: problems of production and their solution. // Russ. J. Plant Physiol. 2022. V. 69. P. 132. https:doi.org/10.1134/S1021443722020157
  3. Oey M., Lohse M., Kreikemeyer B., Bock R. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic // Plant J. 2009. V. 57. P. 436. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03702.x
  4. Scotti N., Cardi T. Transgene-induced pleiotropic effects in transplastomic plants // Biotechnol Lett. 2014. V. 36. P. 229. https:doi: 10.1007/s10529-013-1356-6
  5. Fuentes P., Armarego-Marriott T., Bock R. Plastid transformation and its application in metabolic engineering // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 49. P. 10. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2017.07.004
  6. Jensen P.E., Scharff L.B. Engineering of plastids to optimize the production of high-value metabolites and proteins // Curr. Opin. Biotechnol. 2019. V. 59. P. 8. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2019.01.009
  7. Bock R. Transplastomic approaches for metabolic engineering // Curr. Opin. Plant Biol. 2022. V. 66. Р. 102185. https:doi.org/10.1016/j.pbi.2022.102185
  8. Daniell H., Lin Ch.-S., Yu M., Chang W.-J. Chloroplast genomes: diversity, evolution, and applications in genetic engineering // Genome Biol. 2016. V. 17. Р. 134. https:doi.org/10.1186/s13059-016-1004-2
  9. Yu Y., Yu P.-C., Chang W.-J., Yu K., Lin C.-S. Plastid transformation: how does it work? Can it be applied to crops? What can it offer? // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. Р. 4854. https:doi.org/10.3390/ijms21144854
  10. Bock R. Engineering plastid genomes: methods, tools, and applications in basic research and biotechnology // Ann. Rev. Plant Biol. 2015. V. 66. P. 211. https:doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-040212
  11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473. https:doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
  12. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. Inheritance of functional foreign genes in plants // Sci. 1984. V. 223. P. 496. https:doi: 10.1126/science.223.4635.496
  13. Allen G., Flores-Vergara M., Krasynanski S., Kumar S., Thompson W.F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 2320. https:doi.org/10.1038/nprot.2006.384
  14. Drescher A., Ruf S., Calsa T.Jr., Carrer H., Bock R. The two largest chloroplast genome-encoded open reading frames of higher plants are essential genes. // Plant J. 2000. V. 22. P. 97. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.2000.00722.x
  15. Shen H., Qian B., L Yang., Liang W., Chen W., Liu Z., Zhang D. Estimation of the homoplasmy degree for transplastomic tobacco using quantitative real-time PCR // Eur. Food Res. Technol. 2010. V. 231. P. 143. https:doi: 10.1007/s00217-010-1265-z
  16. Yu Q., LaManna L.M., Kelly M.E., Lutz K.A., Maliga P. New tools for engineering the arabidopsis plastid genome // Plant Physiol. 2019. V. 181. P. 394. https:doi.org/10.1104/pp.19.00761
  17. Yu Q., Tungsuchat-Huang T., Verma K., Radler M.R., Maliga P. Independent translation of ORFs in dicistronic operons, synthetic building blocks for polycistronic chloroplast gene expression // Plant J. 2020. V. 103. P. 2318. https:doi.org/10.1111/tpj.14864
  18. Herz S., Füßl M., Steiger S. Koop H.-U. Development of novel types of plastid transformation vectors and evaluation of factors controlling expression // Transgenic Res. 2005. V. 14. P. 969. https:doi.org/10.1007/s11248-005-2542-7
  19. Tangphatsornruang S., Birch-Machin I., Newell C.A., Gray J.C. The effect of different 3′ untranslated regions on the accumulation and stability of transcripts of a gfp transgene in chloroplasts of transplastomic tobacco // Plant Mol. Biol. 2011. V. 76. P. 385. https:doi.org/10.1007/s11103-010-9689-1
  20. Dhingra A., Daniell H. Chloroplast genetic engineering via organogenesis or somatic embryogenesis // Meth. Mol. Biol. 2006. V. 323. P. 245. https:doi: 10.1385/1-59745-003-0:245.
  21. Ruhlman T., Verma D., Samson N., Daniell H. The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression // Plant Physiol. 2010. V. 152. P. 2088. https:doi.org/10.1104/pp.109.152017
  22. Lacroix B., Citovsky V. Biolistic approach for transient gene expression studies in plants // Meth. Mol. Biol. 2020. V. 2124. P. 125. https:doi.org/10.1007/978-1-0716-0356-7_6
  23. Hibberd J.M., Linley Ph.J., Khan M.S., Gray J.C. Transient expression of green fluorescent protein in various plastid types following microprojectile bombardment // Plant J. 1998. V. 16. P. 627. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00328.x
  24. Kwak S.Y., Lew T.T.S., Sweeney C.J., Koman V.B., Wong M.H., Bohmert-Tatarev K., Snell K.D., Seo J.S., Chua N.H., Strano M.S. Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers // Nat. Nanotech. 2019. V. 14. P. 447. https:doi.org/10.1038/s41565-019-0375-4
  25. Daniell H., Ruiz G., Denes B., Sandberg L., Langridge W. Optimization of codon composition and regulatory elements for expression of human insulin like growth factor-1 in transgenic chloroplasts and evaluation of structural identity and function // BMC Biotech. 2009. V. 9. Р. 33. https:doi.org/10.1186/1472-6750-9-33
  26. Khakhlova O., Bock R. Elimination of deleterious mutations in plastid genomes by gene conversion. // Plant J. 2006. V. 46. P. 85. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2006.02673.x
  27. Gerasymenko I.M., Sheludko Y.V., Klebanovych A.A., Rudas V.A., Shakhovsky A.M., Klein T.M., Kuchuk N.V. Comparison of effectiveness of 5′-regulatory sequences in transplastomic tobacco chloroplasts // Transgenic Res. 2017. V. 26. P. 65. https:doi.org/10.1007/s11248-016-9980-2
  28. Sheludko Y.V., Gerasymenko I.M., Herrmann F.J., Warzecha H. Evaluation of biotransformation capacity of transplastomic plants and hairy roots of Nicotiana tabacum expressing human cytochrome P450 2D6 // Transgenic Res. 2022. V. 31. P. 351. https:doi.org/10.1007/s11248-022-00305-x
  29. Wang Y., Wei Zh., Fan J., Song X., Xing Sh. Hyper-expression of GFP-fused active hFGF21 in tobacco chloroplasts // Protein Expr. Purif. 2023. V. 208. Р. 106271. https:doi.org/10.1016/j.pep.2023.106271.
  30. Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.-M.I., Maloney A.P., Kavanagh T.A., Gray J.C., Bock R. High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes // Plant Biotech. J. 2008. V. 6. P. 897. https:doi.org/10.1111/j.1467-7652.2008.00356.x
  31. Kwon K.-C., Chan H.-T., Leon I.R., Williams-Carrier R., Barkan A., Daniell H. Codon optimization to enhance expression yields insights into chloroplast translation // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 62. https:doi.org/10.1104/pp.16.00981

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема генетической конструкции pPlastEx-GFP для экспрессии генов egfp и aadA в пластидах (хлоропластах) табака. PrrnG10L – промотор оперона рРНК (Prrn), слитый с лидерной последовательностью гена 10 фага Т7 (G10L), egfp – кодирующая последовательность гена зеленого флуоресцирующего белка, RBS – сайт связывания рибосом, aadA – кодирующая последовательность гена устойчивости к спектиномицину, TpsbA – терминатор гена psbA, кодирующего белок D1 фотосистемы II, LF и RF – левая и правая фланкирующие последовательности.

Скачать (84KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Оценка экспрессионной активности генетической конструкции pPlastEx_GFP в клетках E. coli. а-г – клетки E. coli, трансформированные экспрессионным вектором, на питательной среде с различным содержанием спектиномицина. (а) – 50 мг/л; (б) – 100 мг/л; (в) – 200 мг/л; (г) – 400 мг/л. Зеленый цвет – флуоресценция eGFP. * – колонии не экспрессирующие egfp.

Скачать (528KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации в 1% агарозном геле (на примере 7 образцов), подтверждающая наличие генов aadA и egfp в геноме транспластомных растений. М – маркер молекулярных весов Step100 Long.

Скачать (171KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Детекция рекомбинантного eGFP с помощью конфокальной микроскопии на примере замыкающих клеток устьиц в листьях табака. а – флуоресценция eGFP в хлоропластах; б – автофлуоресценция хлоропластов; в – фазовый контраст; г – совмещение. Масштабная линейка: 10 мкм.

Скачать (667KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Накопление рекомбинатного eGFP-белка в линиях транспластомных растений и ядерных трансформантов. а – транспластомные растения табака поколения T1, полученные от самоопыления исходных T0 трансформантов; б – транспластомные растения-регенеранты табака R2, полученные в результате двух раундов регенерации из листовых эксплантов исходных транспластомных трансформантов T0 (синие столбики – транспластомные растения T1 поколения, для сравнения, полученные от тех же самых исходных T0); в – ядерные трансформанты поколения T0.

Скачать (499KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Уровень экспрессии генов aadA и egfp в составе генетической конструкции pPlastEx_GFP в пластидах транспластомных растений по накоплению матричной РНК. а – растения поколения Т1; б – растения регенеранты поколения R2; синий цвет (1) – aadA; зеленый цвет (2) – egfp; отн. ед. – относительные единицы.

Скачать (323KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Определение гомоплазмии транспластомных растений. а – в транспластомных растениях Т1 поколения; б – в транспластомных растениях-регенерантах R2: желтый цвет (1) – ген aadA; зеленый цвет (2) – ген egfp; красная рамка – границы гомоплазмии; отн. ед. – относительные единицы.

Скачать (362KB)
Метаданные
9. Приложение
Скачать (372KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024