Применение технологии Detectr для селективной детекции бактериального фитопатогена Dickeya solani с использованием рекомбинантной CRISPR-нуклеазы Cas12a, полученной одностадийной хроматографической очисткой

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

В работе показано, что рекомбинантная CRISPR-нуклеаза Cas12a, полученная упрощенным методом очистки после ее гетерологической экспрессии с применением одностадийной металл-хелатной хроматографии, может быть успешно использована в технологии DETECTR. Полученная таким способом CRISPR-нуклеаза Cas12a в комбинации с рекомбиназной полимеразной амплификацией позволила обеспечить селективность детекции Dickeya solani — опасного фитопатогена, вызывающего заболевание картофеля, известное как “черная ножка”, с пределом обнаружения 1 копия бактериального генома на реакцию амплификации. Результат может быть определен визуально, без использования сложных инструментальных методов, по изменению окраски реакционной пробы при освещении синим светом, что создало основу для разработки полевой ДНК-диагностики D. solani. Применение упрощенной хроматографической очистки позволит существенно снизить затраты времени и ресурсов, необходимые для получения функционально активной CRISPR-нуклеазы Cas12a, при разработке и производстве ДНК-диагностикумов на основе технологии DETECTR.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Л. К. Курбатов

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича

Автор, ответственный за переписку.
Email: kurbatovl@mail.ru
Россия, Москва, 119121

С. П. Радько

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича; Тюменский государственный университет, Западносибирский межрегиональный научно-образовательный центр

Email: radkos@yandex.ru
Россия, Москва, 119121; Тюмень, 625003

С. А. Хмелева

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича

Email: kurbatovl@mail.ru
Россия, Москва, 119121

К. Г. Птицын

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича

Email: kurbatovl@mail.ru
Россия, Москва, 119121

О. С. Тимошенко

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича

Email: kurbatovl@mail.ru
Россия, Москва, 119121

А. В. Лисица

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича; Тюменский государственный университет, Западносибирский межрегиональный научно-образовательный центр

Email: kurbatovl@mail.ru
Россия, Москва, 119121; Тюмень, 625003

Список литературы

  1. Kaminski M. M., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Zhang F., Collins J. J. // Nat. Biomed. Eng. 2021. V. 5. № 7. P. 643–656.
  2. Fapohunda F. O., Qiao S., Pan Y., Wang H., Liu Y., Chen Q., Lü P. // Microbiol. Res. 2022. V. 259. P. 127000. https://doi.org/10.1016/j.micres.2022.127000
  3. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Lee J. W., Essletzbichler P., Dy A. J., Joung J. et al. // Science. 2017. V. 356. № 6336. P. 438–442.
  4. Chen J. S., Ma E., Harrington L. B., Da Costa M., Tian X., Palefsky J. M., Doudna J. A. // Science. 2018. V. 360. № 6387. P. 436–439.
  5. Yuan B., Yuan C., Li L., Long M., Chen Z. // Molecules. 2022. V. 27. № 20. P. 6999. https://doi.org/10.3390/molecules27206970
  6. Lobato I. M., O’Sullivan C.K. // Trends Analyt. Chem. 2018. V. 98. P. 19–35.
  7. Zetsche B., Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Slaymaker I. M., Makarova K. S., Essletzbichler P. et al. // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 759–771.
  8. Chen J., Huang Y., Xiao B., Deng H., Gong K., Li K., Li L., Hao W. // Front Microbiol. 2022. V. 13. P. 842415. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.842415
  9. Курбатов Л. К., Радько С. П., Кравченко С. В., Киселёва О. И., Дурманов Н. Д., Лисица А. В. // Прикл. биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. № 6. P. 587–594.
  10. van der Wolf J. M., Nijhuis E. H., Kowalewska M. J., Saddler G. S., Parkinson N., Elphinstone J. G. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014. V. 64. № 3. P. 768–774.
  11. Toth I. K., van der Wolf J. M., Saddler G., Lojkowska E., Helias V., Pirhonen M. et al. // Plant Pathol. 2011. V. 60. № 3. P. 385–399.
  12. Pritchard L., Humphris S., Saddler G. S., Parkinson N. M., Bertrand V., Elphinstone J. G., Toth I. K. // Plant Pathol. 2013. V. 62. № 3. P. 587–596.
  13. Humphris S. N., Cahill G., Elphinstone J. G., Kelly R., Parkinson N. M., Pritchard L., Toth I. K., Saddler G. S.// Methods Mol. Biol. 2015. V. 1302. P. 1–16.
  14. Van Vaerenbergh J., Baeyen S., De Vos P., Maes M. // PloS One. 2012. V. 7. № 5. P. e35738. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035738
  15. Ivanov A. V., Safenkova I. V., Drenova N. V., Zherdev A. V., Dzantiev B. B. // Mol. Cell. Probes. 2020. V. 53. P. 101622. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2020.101622
  16. Suprun E. V., Khmeleva S. A., Kutdusova G. R., Ptitsyn K. G., Kuznetsova V. E., Lapa S. A. et al. // Electrochem. Commun. 2021. V. 131. P. 107120. https://doi.org/10.1016/j.elecom.2021.107120
  17. Murugan K., Seetharam A. S., Severin A. J., Sashital D. G. // J. Biol. Chem. 2020. V. 295. P. 5538–5553.
  18. Mohanraju P., Oost J., Jinek M. Swarts D. // Bio-protocol. 2018. V. 8. P. e2842. https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2842
  19. Moreno-Mateos M. A., Fernandez J. P., Rouet R., Vejnar C. E., Lane M. A., Mis E. et al. // Nat. Commun. 2017. V. 8. № 1. P. 2024. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01836-2
  20. Tran M. H., Park H., Nobles C. L., Karunadharma P., Pan L., Zhong G., Wang H. et al. // Mol. Ther. Nucleic Acids. 2021. V. 24. P. 40–53.
  21. Owens R.M, Grant A., Davies N., O’Connor C.D. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 21. № 2. P. 352–360.
  22. Kurbatov L. K., Radko S. P., Khmeleva S. A., Timoshenko O. S., Lisitsa A. V. // Biomed. Chem. Res. Meth. 2022. V. 5. № 4. P. e00177. https://doi.org/10.18097/BMCRM00177
  23. Khayi S., Blin P., Chong T. M., Robic K., Chan K. G., Faure D. // Genome Announc. 2018. V. 6. № 4. P. e01447–17. https://doi.org/10.1128/genomeA.01447-17

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Электрофорез в ПААГ гомогената клеток E. coli, экспрессирующих рекомбинантную CRISPR-нуклеазу Cas12a, и фракций элюата, полученных при очистке целевого белка металл-хелатной хроматографией на колонках Protino Ni-TED1000: М — маркеры молекулярных масс, 1 — гомогенат клеток, 2–6 — фракции элюата, 7 — объединенные фракции после диализа. Целевой белок показан стрелкой I, основной белок-загрязнитель — стрелкой II.

Скачать (91KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результаты электрофоретического анализа продуктов РПА для штаммов фитопатогенов (табл. 2) (а) и тестирование продуктов РПА комплексом нРНК/Cas12а (б): М — ДНК-стандарты, 1 — P. carotovorum ssp. carotovorum, 2 — P. odoriferum, 3 — C. michiganensis ssp. sepedonicus, 4 — P. brasiliense (штамм 466), 5 — P. brasiliense (штамм 497), 6 — D. solani. Геномная ДНК 0.5 пг на РПА-пробу. Целевой продукт амплификации указан стрелкой. б — Характерные зависимости разницы флуоресценций пробы с добавлением продуктов РПА и контрольной пробы без добавления продуктов РПА (F–F0, у. е.) от времени инкубации (мин). (1 мкл РПА-пробы на тест-пробу с нРНК-3/Cas12а. Концентрация нРНК-3 – 30 нМ, концентрация Cas12а — 30 нМ.)

Скачать (148KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты электрофоретического анализа продуктов РПА для различного количества бактериальных геномов D. solani в присутствии 1 нг ДНК картофеля (а) и тестирования продуктов РПА комплексом нРНК-3/Cas12а (б): М — ДНК-стандарты, 1–5 — количество копий бактериальных геномов на РПА-пробу 1, 10, 100, 1000 и 10000 соответственно. Целевой продукт амплификации указан стрелкой. б — Характерные зависимости разницы флуоресценции пробы с добавлением продуктов РПА и контрольной пробы без добавления продуктов РПА (F–F0, у. е.) от времени инкубации (мин). (1 мкл РПА-пробы на тест-пробирку с нРНК/Cas12а. Концентрация нРНК-3 – 30 нМ, концентрация Cas12а — 30 нМ).

Скачать (167KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Характерные зависимости разницы флуоресценций пробы с добавлением продуктов РПА и контрольной пробы без добавления продуктов РПА (F–F0, у. е.) от времени инкубации (мин): 1 и 2 — концентрации CRISPR-нуклеазы Cas12a 90 и 150 нМ соответственно. Молярное отношение нРНК-3/Cas12а = 1. (1 мкл РПА-пробы на тест-пробу с нРНК-3/Cas12а. 1 копия бактериального генома на РПА-пробу). На врезке: 1 — контрольная проба, 2 — проба как на кривой 2 рис. 4. Облучение синим светом (400–500 нм), оранжевый светофильтр.

Скачать (87KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024