Associations of the rs1132896 polymorphism of the matrix metalloproteinase type 2 gene with the development of acute cerebrovascular accident: prospective case–control study

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) — это гетерогенное заболевание сосудистого генеза, характеризующееся высокой смертностью и инвалидностью лиц, переживших это состояние. И если средовые факторы ОНМК изучены неплохо, то спектр факторов генетических постепенно расширяется и подвергается осмыслению.

Однонуклеотидный вариант rs1132896 локализуется на хромосоме 16, положение 55485623. Мутации в этом варианте гена матриксной металлопротеиназы 2-го типа (MMP-2) влияют на активность матриксных металлопротеиназ (ММП), в частности, внеклеточных цинк- и кальций-зависимых ферментов эндопептидаз, которые ремоделируют белки внеклеточного матрикса сосудистых стенок, что опосредованно может приводить к развитию ишемического инсульта.

В литературе появляется всё больше сведений о том, что MMП (в частности, MMП-2) являются предикторами ишемического инсульта. Так, F. Niu и соавт. [1] изучали взаимосвязь между ММП-2 и риском развития инсульта в популяции Южного Китая. Ими были оценены однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) ММП-2 у пациентов с инсультом в ассоциативном исследовании с использованием схемы случай–контроль. 6 SNP MMП-2 были отобраны и генотипированы при помощи систем генетического анализа Agena MassARRAY. SNPStats, Haploview. 2 SNP в гене MMP-2 оказались статистически значимо связаны с риском развития инсульта. В частности, аллель C rs1132896 значительно снижал риск развития инсульта (отношение шансов, ОШ=0,56, 95% доверительный интервал, 95% ДИ, 0,39–0,81; p=0,002). Представленные результаты убедительно указывают на то, что генетические варианты MMП-2 являются важным медиатором риска наступления инсульта.

Некоторые литературные источники свидетельствуют о том, что ММП играют фундаментальную роль и в восстановлении после инсульта [2]. ММП — это семейство из более чем 20 протеиназ, широко распространённых в тканях человека. Они способны разрушать почти все белки внеклеточного матрикса и необходимы для миграции клеток, процессов заживления, образования рубцов и других изменений тканей [3, 4].

Помимо функций в процессах заживления и наращивания матрикса, множество данных свидетельствует о том, что содержание ММП-2 в сыворотке крови повышается при инсульте [5–7]. Таким образом, становится ясно, что генетические факторы способствуют развитию ишемического инсульта.

В экспериментальных моделях черепно-мозговой травмы некоторые ММП не регулируются после ишемии [8, 9], кровоизлияния [10] и травмы [11]. Накапливаются доказательства того, что MMП играют важную роль и при острой черепно-мозговой травме [12]. Плейотропность эффектов ММП была доказана путём выявления полиморфизмов MMП при различных заболеваниях. Установлены ассоциации ММП и с заболеваемостью раком [13] и ишемической болезнью сердца [14]. В русскоязычной литературе сведений об ассоциации полиморфизма гена MMP-2 с ОНМК не найдено, в связи чем было решено экстраполировать результаты зарубежных исследований в этой области на российскую популяцию.

Цель исследования — изучить ассоциации полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 с развитием ОНМК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено проспективное исследование случай–контроль.

Критерии соответствия

Критерии включения:

• лица женского и мужского пола с ОНМК;
• возраст старше 18 лет;
• место проживания — г. Красноярск или Красноярский край;
• способность больного выполнять необходимые процедуры;
• согласие пациента на участие в исследовании.

Критерии невключения:

• неуточнённый диагноз у пациента;
• возраст младше 18 лет;
• проживание обследуемого вне Красноярского края.

Критерии исключения:

• неспособность обследуемого проходить необходимые процедуры;
• пациенты, не желающие выполнять протокол исследования или процедуры.

Критерии включения в контрольную группу:

• пациенты, сопоставимые по полу и возрасту с основной группой исследования;
• пациенты без сердечно-сосудистых заболеваний и факторов риска, за исключением артериальной гипертензии.

Условия проведения

Набор лиц в основную группу происходил в 2 стационарах: КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница № 20 им. И.С. Берзона» (КГБУЗ КМКБ № 20) и Федеральном Сибирском научно-клиническом центре ФМБА России (Красноярск). Поскольку исследование проводили на базе 2 крупных государственных больниц, все приборы для исследования и проведения КТ, электрокардиографии (ЭКГ), эхокардиоскопии (ЭхоКС), дуплексного сканирования экстракраниальных брахиоцефальных артерий, а также суточные мониторы артериального давления и сердечного ритма, приборы для измерения лабораторных показателей проходили соответствующую поверку (согласно графику периодической поверки сертифицированная организация проверяет соответствие работы оборудования определённым утвержденным стандартам). Исходных знаний и средств было достаточно для достижения вышеназванной цели исследования. Методология исследования перед исследованием была отработана и принята Этическим комитетом КрасГМУ им. В.Ф. Войно-Ясенецкого.

Продолжительность исследования

Набор лиц основной группы осуществляли в течение 3 лет, с сентября 2019 по сентябрь 2021 года.

Целевые показатели исследования

• Первичная конечная точка исследования — регистрация ОНМК у пациента.
• Вторичные конечные точки исследования — сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, которые диагностируются у пациента.

Методы измерения целевых показателей

Методы регистрации ОНМК и сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы — проведение КТ головного мозга, ЭКГ, ЭхоКС, ультразвукового дуплексного сканирования экстракраниальных брахиоцефальных артерий, суточного мониторирования артериального давления и сердечного ритма, анализ свёртывающей системы крови. Комплекс проводящихся исследований был направлен на диагностику ОНМК у пациентов, верификацию сопутствующей сердечно-сосудистой патологии и факторов риска развития ОНМК. У всех наблюдаемых лиц основной группы был диагностирован ишемический инсульт. У 19 человек (13 мужчин и 6 женщин) зарегистрировали повторный эпизод ОНМК. В основной группе пациентов не было выявлено ишемической болезни сердца. Наиболее частым сердечно-сосудистым заболеваниям, предшествующим ОНМК, оказались артериальная гипертензия (249 человек, из них 153 мужчины и 96 женщин). Нарушения сердечного ритма в виде пароксизмальных наджелудочковых тахикардий (в это число входит и фибрилляция предсердий) зарегистрированы у 31 человека (20 мужчин и 11 женщин).

Перечень факторов риска в группе ОНМК следующий:

• дислипидемия (159 пациентов, из них 95 мужчин и 64 женщины);
• атеросклероз брахиоцефальных артерий (160 пациентов, из них 94 мужчины и 66 женщин);
• нарушения системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции (90 пациентов, из них 53 мужчины и 37 женщин);
• у 28 пациентов (19 мужчин и 9 женщин) имелись родственники с ОНМК.

Контрольная группа нашего исследования — это популяционная выборка населения г. Новосибирска. Их обследование осуществляли по стандарту международного проекта HAPIEE, выполненного в 2013–2017 гг. С пациентами контрольной группы был реализован ряд процедур:

• проводили опрос (социально-экономические условия жизни, хронические заболевания, состояние психического и физического здоровья);
• определяли конституциональные особенности (рост, масса тела, объём талии и бёдер);
• предлагали им опросник о курении, объёме употребляемого алкоголя (частота и типичная доза);
• измеряли цифры артериального давления, оценивали липидный спектр крови;
• проводили анкетирование на диагностику стенокардии напряжения (Rose), ЭКГ покоя в 12 отведениях;
• выполняли обследование на респираторные и когнитивные функции.

Артериальная гипертензия в группе сравнения была верифицирована у 177 человек (из них 98 мужчин и 79 женщин). Иных сердечно-сосудистых заболеваний и также факторов риска их развития на момент обследования в группе сравнения зафиксировано не было.

Молекулярно-генетический анализ венозной крови пациентов с ОНМК и здоровых лиц проводили в НИИ терапии и профилактической медицины – филиале «ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН» (Новосибирск). Геномную ДНК выделяли из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Однонуклеотидные последовательности rs662799 тестировали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с протоколом фирмы- производителя (зонды TaqMan, «Applied Biosystems», США) на приборе StepOnePlus («Applied Biosystems», США). Результаты молекулярно-генетического анализа представлены на 318 пациентах основной и 323 пациентах контрольной группы.

Анализ в подгруппах

Наряду с анализом ассоциаций полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 в общей группе, мы отдельно проводили анализ ассоциаций в группе мужчин и в группе женщин.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено Этическим комитетом КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (протокол № 324 от 05.09.2019). Все пациенты подписали письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ

Принципы расчёта размера выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением набора прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0 (StatSoft Inc., США), MedCalc 22.006 (Microsoft, США) и SPSS Statistics v. 22 (IBM, США). При выполнении статистического анализа использовали типовой порядок проведения статистических процедур, при этом способы статистической обработки были использованы в соответствии с характером учётных признаков и числа групп сравнения. Точный критерий Фишера применяли в том случае, когда желаемые частоты имели значение <5. Относительный риск вероятности заболевания по конкретному аллелю или генотипу рассчитывали как отношение шансов (ОШ). Данные представлены в виде абсолютных значений, доли (%) от абсолютных значений, вычисления среднего квадратичного значения, стандартной девиации, t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Участники исследования

С целью определения ассоциации полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 с формированием ОНМК нами было обследовано 318 больных с диагнозом ОНМК и 323 человека контрольной группы. Возраст пациентов основной группы составил от 32 до 69 лет [57, 0; 51, 0–62, 0]. У пациентов контрольной группы возраст был сопоставим с таковым в основной: от 37 до 68 лет [55, 0; 51, 0–62, 0]. Половой диморфизм был следующим: 191 мужчина (возраст [56, 5; 51, 0–62, 0]) и 127 женщин (возраст [57, 0; 51, 0–62, 0]). Половой состав лиц контрольной группы соответствовал таковому лиц основной: 214 мужчин (возраст [55, 0; 51, 0–62, 0]) и 109 женщин (возраст [55, 0; 51, 0–62, 0]).

Основные результаты исследования

Результаты анализа полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных с ОНМК представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Верификация частот генотипов и аллелей полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных с острым нарушением мозгового кровообращения и лиц контрольной группы
Table 1. Verification of the frequencies of genotypes and alleles
of the rs1132896 polymorphism of the MMP-2 gene among patients with acute cerebrovascular accident and in the control group

Полиморфный аллельный вариант	Ишемический инсульт (n=318)		Контроль (n=323)		р
	Абс.	%	Абс.	%
GG	123	38,7	132	40,9	0,339
СG	155	48,7	153	47,4	0,150
СС	40	12,6	38	11,8	0,156
Итого	318	100,0	323	100,0	-
Аллели
	Абс.	%	Абс.	%
Аллель G	401	63,1	417	64,6	0,324
Аллель С	235	36,9	229	35,4	0,436
Итого	636	100,0	646	100,0	-
GG	123	38,7	132	40,9	0,508
СG + СС	195	61,3	191	59,1	0,564
Итого	318	100,0	323	100,0	-

Примечание (здесь и в табл. 2, 3). р — уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля.

Note (here and in Tables 2, 3). р — is the level of significance when comparing the distribution of genotypes with the indicators of the control group.

 

В основной группе больных с ОНМК преобладали лица с гетерозиготным генотипом CG: n=155 (48,7%). Частота встречаемости распространённого генотипа GG составила 122 (38,7%), а редкого гомозиготного генотипа СС — 40 (12,6%). В контрольной группе также преобладали лица с гетерозиготным генотипом CG: n=153 (47,4%). Число носителей гомозиготного генотипа GG составило 132 (40,9%), а гомозиготного генотипа СС по редкому аллелю — 38 (11,8%; см. табл. 1) человек. Статистической значимости зафиксировано не было (p=0,150), но отмечена тенденция к увеличению частоты встречаемости гетерозиготного генотипа СG у больных с ишемическим инсультом.

Результаты исследования полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных ОНМК мужчин представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Установленные частоты генотипов и аллелей полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных мужчин с острым нарушением мозгового кровообращения и мужчин контрольной группы
Table 2. Established frequencies of genotypes and alleles of the rs1132896 polymorphism of the MMP-2 gene among sick men with acute cerebrovascular accident and men in the control group

Полиморфный аллельный вариант	ОНМК, мужчины (n=191)		Контроль, мужчины (n=214)		р
	Абс.	%	Абс.	%
GG	79	41,4	83	38,8	0,156
СG	88	46,1	111	51,9	0,710
СС	24	12,6	20	9,3	0,0324
Итого	191	100,0	214	100,0	-
Аллели
	Абс.	%	Абс.	%
Аллель G	246	64,4	277	64,7	0,806
Аллель С	136	35,6	151	35,3	0,801
Итого	382	100,0	428	100,0	-
GG	79	41,4	83	38,8	0,506
СG + СС	112	58,6	131	61,2	0,324
Итого	191	100,0	214	100,0	-

 

В основной группе больных мужчин с ишемическим инсультом преобладали лица с гетерозиготным генотипом CG: n=88 (46,1%). Частота встречаемости распространённого гомозиготного генотипа GG составила 79 (41,4%), а редкого гомозиготного генотипа СС — 24 (12,6%). В контрольной группе преобладали мужчины с гетерозиготным генотипом CG: n=111 (51,9%). Число мужчин-носителей гомозиготного генотипа GG, составило 83 (38,8%), а гомозиготного генотипа СС по редкому аллелю — 20 (9,3%; см. табл. 2) человек. При анализе статистической значимости получено значимое преобладание гомозиготного генотипа CC в группе больных мужчин с ОНМК: n=24 (12,6%) vs n=20 (9,3%; p=0,0324). Таким образом, этот генотип можно рассматривать как генетический предиктор развития ОНМК у мужчин.

Результаты анализа полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных ишемическим инсультом женщин представлены в табл. 3. В основной группе больных женщин с ишемическим инсультом преобладали лица с гетерозиготным генотипом CG: n=67 (52,8%). Частота встречаемости распространённого гомозиготного генотипа GG составила 44 (34,6%), а редкого гомозиготного генотипа СС — 16 (12,6%). В контрольной группе число женщин с распространённым гомозиготным генотипом GG составило 49 (45,0%), с гетерозиготным генотипом CG — 42 (38,5%), а с гомозиготным генотипом СС по редкому аллелю — 18 (16,5%; см. табл. 3) человек. При проведении статистического анализа в группе женщин отмечено значимое преобладание гетерозиготного генотипа CG у женщин с ОНМК: n=67 (52,8%) vs n=42 (38,5%; p=0,042). Таким образом, гетерозиготный генотип CG у женщин является генетическим предиктором развития ОНМК. Подобная тенденция отмечена и в общей группе обследуемых с ОНМК.

 

Таблица 3. Определённые частоты генотипов и аллелей полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 среди больных женщин с острым нарушением мозгового кровообращения и женщин контрольной группы
Table 3. Certain frequencies of genotypes and alleles of the rs1132896 polymorphism of the MMP-2 gene among sick women with acute cerebrovascular accident and women in the control group

Полиморфный аллельный вариант	ОНМК, женщины (n=127)		Контроль, женщины (n=109)		р
	Абс.	%	Абс.	%
GG	44	34,6	49	45,0	0,802
СG	67	52,8	42	38,5	0,042
СС	16	12,6	18	16,5	0,513
Итого	127	100,0	109	100,0	-
Аллели
	Абс.	%	Абс.	%
Аллель G	155	61,0	140	64,2	0,203
Аллель С	99	39,0	78	35,8	0,324
Итого	254	100,0	218	100,0	-
GG	44	34,6	49	45,0	0,082
СG + СС	83	65,4	60	55,0	0,076
Итого	127	100,0	109	100,0	-

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Исследование проведено с целью выявления ассоциаций полиморфизма rs1132896 гена MMP-2 с развитием ОНМК. Изучены молекулярно-генетические основы развития ОНМК в сибирской популяции, в частности, полиморфизм rs1132896 у пациентов с ОНМК. Исследован половой диморфизм заболевания, то есть выявлены генетические предикторы ОНМК в группе лиц мужского пола, гомозиготный генотип CC исследуемого гена можно рассматривать как генетический предиктор развития ОНМК в группе больных мужчин с ОНМК. В группе женщин с верифицированным ОНМК статистически значимо преобладал гетерозиготный генотип CG гена MMP-2, что также позволяет использовать его в диагностическом поиске в качестве генетического предиктора развития заболевания.

Обсуждение основного результата исследования

В настоящее время исследователями уделяется значительное внимание роли ММП в развитии ишемического инсульта. Причины развития ОНМК многообразны. Наряду с большим числом средовых факторов, всё больше учёных обращают внимание на генетические факторы риска развития ОНМК. В последние годы в ряде зарубежных публикаций появились данные об участии ММП (и конкретно ММП-2) в развитии ОНМК.

В нашей работе в российской популяции пациентов при анализе статистической значимости получено значимое преобладание гомозиготного генотипа CC в группе больных мужчин с ОНМК (12,6% vs 9,3%). Кроме того, в группе женщин зафиксировано статистически значимое преобладание гетерозиготного генотипа CG у женщин с ОНМК (52,8% vs 38,5%). Поскольку мутации в этом варианте гена MMP-2 влияют на активность ММП, в частности, внеклеточных цинк- и кальций- зависимых ферментов эндопептидаз, то происходит ремоделирование белков внеклеточного матрикса сосудистых стенок, что опосредованно может привести к развитию ишемического инсульта.

Прикладной характер работы очевиден. Так, расширение спектра генетических маркёров ОНМК может способствовать улучшению стратификации риска заболевания и целенаправленной и своевременной профилактике у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Носители патологических генотипов представляют собой особую популяцию высокого генетического риска развития ОНМК, поэтому именно эти лица с факторами риска развития ОНМК прежде всего составляют приоритетную группу диспансерного наблюдения. В этой группе необходима организация эффективных целевых профилактических мероприятий, направленных на улучшение качества жизни пациентов и предотвращение у них исключительно высокой преждевременной смертности. Такой подход в большой степени актуален для амбулаторного звена здравоохранения и может быть успешно использован в поликлинической работе. Внедрение генетического рискометра мультифакториальной модели развития ОНМК при сердечно-сосудистых заболеваниях, которое проводится в крупной больнице г. Красноярска — КГБУЗ КМКБ № 20 — позволит предотвратить ряд сердечно-сосудистых катастроф.

Ограничения исследования

Наше исследование выполнено по схеме случай– контроль. Генеральная совокупность в исследовании — это популяция жителей г. Красноярска и Красноярского края, где мы выявляли случаи ОНМК. На эту популяцию до начала исследования воздействовали различные факторы риска, но факт их воздействия на отдельные лица популяции установить невозможно, то есть этот аспект остаётся неизвестным.

Исследование случай–контроль начинают сразу с составления групп сравнения. В идеале обе группы сравнения должны отбираться из одной популяции. Группа контроля в нашем исследовании набиралась из популяционной выборки жителей г. Новосибирска, учитывая практически одинаковые характеристики 2 крупных промышленных городов Сибири, что также можно выделить в качестве ограничения исследования.

Кроме того, выборка в нашем исследовании слишком малочисленна для того, чтобы экстраполировать его результаты на всю российскую популяцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гомозиготный генотип CC у мужчин и гетерозиготный генотип CG у женщин являются генетическими предикторами развития ОНМК. Таким образом, поскольку каждая популяция имеет свои генетические особенности, очень важна экстраполяция результатов уже полученных исследований на новые популяции для расширения наших знаний, практического опыта и правильной тактики ведения пациентов. Снижение смертности от сердечно-сосудистых заболеваний достигается различными направлениями работы. Первичная профилактика — одно из направлений работы врача, прежде всего — врача первичного звена здравоохранения. При этом очень важным в индивидуализации профилактических мероприятий является использование молекулярно-генетических методов. Результаты нашего исследования могут быть использованы в общетерапевтической практике центров здоровья, а также в консультативных и профилактических кабинетах амбулаторно-поликлинического звена для выделения в семьях лиц высокого риска развития ОНМК.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Вклад авторов. Д.А. Никулин — набор и обработка материала для исследования; А.А. Чернова — работа с литературой; С.Ю. Никулина — анализ полученных результатов; С.В. Прокопенко — неврологический осмотр пациентов; И.И. Черкашина — работа с контрольной группой исследования.

Источник финансирования. Не указан.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

 

ADDITIONAL INFORMATION

Author’s contribution. D.A. Nikulin — collection and processing of material; A.A. Chernova — work with literature; S.Yu. Nikulina — analysis of the results obtained; S.V. Prokopenko — neurological examination of patients; I.I. Cherkashina — work with the control group of the study.

Funding source. Not specified.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

 

About the authors

Dmitrii A. Nikulin

Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Federal Siberian Scientific and Clinical Center

Email: nikulin86@list.ru
SPIN-code: 7122-4397

MD, Cand. Sci. (Med.), assistant

Russian Federation, Krasnoyarsk; Krasnoyarsk

Anna A. Chernova

Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Federal Siberian Scientific and Clinical Center

Email: anechkachernova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2977-1792
SPIN-code: 6094-7406

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Krasnoyarsk; Krasnoyarsk

Svetlana Yu. Nikulina

Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: nicoulina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6968-7627
SPIN-code: 1789-3359

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Krasnoyarsk

Semen V. Prokopenko

Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Federal Siberian Scientific and Clinical Center

Email: s.v.proc.58@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4778-2586
SPIN-code: 1279-7072

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Krasnoyarsk; Krasnoyarsk

Irina I. Cherkashina

Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: cherkashina@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3825-3946
SPIN-code: 9715-1475

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Krasnoyarsk

References

Supplementary files